PCR, is die polimerase-kettingreaksie, wat verwys na die toevoeging van dNTP, Mg2+, verlengingsfaktore en versterkingsfaktore tot die sisteem onder die katalise van DNA-polimerase, deur die ouer-DNS as 'n sjabloon te gebruik en spesifieke primers as die beginpunt van uitbreiding, Deur die stappe van denaturering, uitgloeiing, verlenging, ens., kan die proses van in vitro replisering van dogterstring-DNA aanvullend tot die ouerstring-sjabloon-DNA vinnig en spesifiek enige teiken-DNS in vitro versterk.
1. Hot Start PCR
Die begintyd van amplifikasie in konvensionele PCR is nie om die PCR-masjien in die PCR-masjien te plaas nie, en dan begin die program om te versterk.Wanneer die stelselkonfigurasie voltooi is, begin die versterking, wat nie-spesifieke versterking kan veroorsaak, en warmbegin PCR kan hierdie probleem oplos.
Wat is warm begin PCR?Nadat die reaksiestelsel voorberei is, word die ensiemmodifiseerder teen hoë temperatuur (gewoonlik hoër as 90°C) vrygestel tydens die aanvanklike verhittingstadium van die reaksie of "warmbegin" stadium, sodat die DNA-polimerase geaktiveer word.Die presiese aktiveringstyd en temperatuur hang af van die aard van die DNA-polimerase en die warmbegin-modifiseerder.Hierdie metode gebruik hoofsaaklik modifiseerders soos teenliggaampies, affiniteitsligande of chemiese modifiseerders om die aktiwiteit van DNA-polimerase te inhibeer.Aangesien die aktiwiteit van DNA-polimerase by kamertemperatuur geïnhibeer word, bied warmbegin-tegnologie groot gerief vir die voorbereiding van veelvuldige PCR-reaksiestelsels by kamertemperatuur sonder om die spesifisiteit van PCR-reaksies in te boet.
2. RT-PKR
RT-PCR (Reverse Transcription PCR) is 'n eksperimentele tegniek vir omgekeerde transkripsie van mRNA na cDNA en om dit as 'n templaat vir amplifikasie te gebruik.Die eksperimentele prosedure is om eers totale RNA in weefsels of selle te onttrek, Oligo (dT) as 'n primer te gebruik, omgekeerde transkriptase te gebruik om cDNA te sintetiseer, en dan cDNA as 'n templaat vir PCR-amplifikasie te gebruik om die teikengeen te verkry of geenuitdrukking op te spoor.
3. Fluorescerende kwantitatiewe PCR
Fluorescerende kwantitatiewe PCR (intydse kwantitatiewe PCR,RT-qPCR) verwys na die metode om fluoresserende groepe by die PKR-reaksiestelsel by te voeg, deur die ophoping van fluoresserende seine te gebruik om die hele PKR-proses intyds te monitor, en uiteindelik die standaardkurwe te gebruik om die sjabloon kwantitatief te ontleed.Algemene gebruikte qPCR-metodes sluit SYBR Green I en TaqMan in.
4. Geneste PCR
Geneste PCR verwys na die gebruik van twee stelle PCR-inleiders vir twee rondtes van PCR-amplifikasie, en die amplifikasieproduk van die tweede rondte is die teikengeenfragment.
As 'n wanpassing van die eerste paar primers (buitenste primers) veroorsaak dat 'n nie-spesifieke produk geamplifiseer word, is die moontlikheid dat dieselfde nie-spesifieke streek deur die tweede paar primers herken word en aanhou amplifiseer baie klein, so die amplifikasie deur die tweede paar primers, is die spesifisiteit van PCR verbeter.Een voordeel van die uitvoering van twee rondtes van PCR is dat dit help om voldoende produk van beperkte aanvangs-DNA te versterk.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR is 'n metode om die spesifisiteit van PCR reaksie te verbeter deur die PCR siklus parameters aan te pas.
In touchdown PCR word die uitgloeitemperatuur vir die eerste paar siklusse 'n paar grade bo die maksimum uitgloeitemperatuur (Tm) van die primers gestel.Hoër uitgloeitemperatuur kan nie-spesifieke amplifikasie effektief verminder, maar terselfdertyd sal hoër uitgloeitemperatuur die skeiding van primers en teikenvolgordes vererger, wat lei tot verlaagde PKR-opbrengs.Daarom word die uitgloeitemperatuur gewoonlik in die eerste paar siklusse gestel om met 1°C per siklus af te neem om die inhoud van die teikengeen in die sisteem te verhoog.Wanneer die uitgloeitemperatuur tot die optimum temperatuur verlaag word, word die uitgloeitemperatuur vir die oorblywende siklusse gehandhaaf.
6. Direkte PCR
Direkte PCR verwys na die amplifikasie van teiken-DNS direk vanaf die monster sonder die behoefte aan nukleïensuur-isolasie en suiwering.
Daar is twee tipes direkte PCR:
direkte metode: neem 'n klein hoeveelheid monster en voeg dit direk by PCR Master Mix vir PCR-identifikasie;
kraakmetode: na monsterneming van die monster, voeg dit by die lysaat, liseer om die genoom vry te stel, neem 'n klein hoeveelheid geliseerde supernatant en voeg dit by PCR Master Mix, voer PCR-identifikasie uit.Hierdie benadering vereenvoudig die eksperimentele werkvloei, verminder praktiese tyd en vermy DNS-verlies tydens suiweringstappe.
7. SOE PCR
Geen splyting deur oorvleueling verlenging PCR (SOE PCR) gebruik primers met komplementêre ente om PCR produkte te maak wat oorvleuelende kettings vorm, sodat in die daaropvolgende amplifikasie reaksie, deur die verlenging van die oorvleuelende kettings, verskillende bronne van A tegniek waarin geamplifiseerde fragmente oorvleuel word en aanmekaar gesit.Hierdie tegnologie het tans twee hooftoepassingsrigtings: konstruksie van samesmeltingsgene;geen plek-gerigte mutasie.
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) gebruik omgekeerde komplementêre primers om DNS-fragmente anders as die twee primers te amplifiseer, en amplifiseer onbekende volgordes aan beide kante van 'n bekende DNS-fragment.
IPCR is oorspronklik ontwerp om die volgorde van aangrensende onbekende streke te bepaal, en word meestal gebruik om geenpromotorvolgordes te bestudeer;onkogene chromosomale herrangskikkings, soos geensamesmelting, translokasie en transposisie;en virale geenintegrasie, word ook nou algemeen gebruik Vir plekgerigte mutagenese, kopieer 'n plasmied met die verlangde mutasie.
9. dPKR
Digitale PCR (dPCR) is 'n tegniek vir die absolute kwantifisering van nukleïensuurmolekules.
Daar is tans drie metodes vir die kwantifisering van nukleïensuurmolekules.Fotometrie is gebaseer op die absorpsie van nukleïensuurmolekules;intydse fluoresserende kwantitatiewe PCR (Real Time PCR) is gebaseer op die Ct-waarde, en die Ct-waarde verwys na die siklusnommer wat ooreenstem met die fluoressensiewaarde wat opgespoor kan word;digitale PCR is die nuutste Kwantitatiewe tegnologie gebaseer op enkel-molekule PCR metode vir die tel van nukleïensuur kwantifisering is 'n absolute kwantitatiewe metode.
Pos tyd: Jun-13-2023