Gebruik en voorsorgmaatreëls van ultrafiltrasie-sentrifugebuis
1) Kies 'n geskikte ultrafiltrasiebuis.Let daarop dat UF-membrane verskil in hul vlak van verdraagsaamheid teenoor verskeie chemikalieë.Tipies kan ultrafiltrasiebuise met 'n 10 kDa molekulêre gewig afsnypunt gekies word met 'n molekulêre gewig afsnypunt wat nie groter as 1/3 van die molekulêre gewig van die proteïen van belang moet wees nie, soos 35 kDa.As die molekulêre gewig van die proteïen van belang ongeveer 10 kd is, kan 'n ultrafiltrasiebuis met 'n molekulêre gewigsgrens van 3 KD gebruik word.
(2) Die ultrafiltrasie, vars gekoop, is droog, met ultrasuiwer water bygevoeg voor gebruik en water heeltemal deur die membraan, ysbad of yskas wat vir 'n paar minute vooraf afgekoel is.Die water word dan afgegooi, dws die proteïenvloeistof, en hoeveel bygevoeg word, wat ook al nie meer is as die wit lyn bo-op die buis nie.Die operasie is lig, en die ultrafiltrasiebuis moet vooraf op ys afgekoel word voordat die proteïenoplossing bygevoeg word.
3) Beide die massa en swaartepunt moes die balans bereik.Let op die rotasiespoed en versnelling is nie baie vinnig nie, anders beskadig die ultrafiltrasiemembraan direk.Sentrifugale ultrafiltrasie is begin (sentrifugeer voorafverkoel tot 4 grade).Nadat die RPM van verskillende sentrifuges na g omgeskakel is, was dit anders.Die versnelling van die sentrifuge is tot 'n minimum aangepas, wat die druk op die membraan verminder het.Let wel, maak seker dat jy die sentrifuge verlaat nadat die sentrifuge sy bestemmingspoed bereik het, of as jy 'n probleem het, kan jy dit nie vir die eerste keer hanteer nie.Die oriëntasie van die membraan na die spil is aangepas volgens die instruksies (hoeksentrifugekas is membraan tot as loodreg).In praktiese gebruik is die algemene rotasiespoed laer as dié in die instruksies, sodat die lewensduur van die sentrifugebuis verleng kan word.
3) Beide die massa en swaartepunt moes die balans bereik.Let op die rotasiespoed en versnelling is nie baie vinnig nie, anders beskadig die ultrafiltrasiemembraan direk.Sentrifugale ultrafiltrasie is begin (sentrifugeer voorafverkoel tot 4 grade).Nadat die RPM van verskillende sentrifuges na g omgeskakel is, was dit anders.Die versnelling van die sentrifuge is tot 'n minimum aangepas, wat die druk op die membraan verminder het.Let wel, maak seker dat jy die sentrifuge verlaat nadat die sentrifuge sy bestemmingspoed bereik het, of as jy 'n probleem het, kan jy dit nie vir die eerste keer hanteer nie.Die oriëntasie van die membraan na die spil is aangepas volgens die instruksies (hoeksentrifugekas is membraan tot as loodreg).In praktiese gebruik is die algemene rotasiespoed laer as dié in die instruksies, sodat die lewensduur van die sentrifugebuis verleng kan word.
(4) Wanneer gekonsentreer tot die oorblywende 1 ml, neem 50 ul bufferoplossing, voeg 10 ul deurvloei by en kyk of daar enige blou kleur is, as 'n oordeel of die ultrafiltrasiebuis proteïen ontbreek.As die buis lek, gooi die boonste laag weer en vloei deur in 'n nuwe buis om ultrafiltrasie te begin.Om presies te bepaal of buise gemis is, sentrifugeer vir 10 minute met 5mgml BSA voor deurvloei, loop op proteïengom, of Bradford ru-toets, en gaan voort deur die oorblywende gekonsentreerde proteïenoplossing (wat op ys werk en verhoed dat proteïene verhit word) by te voeg tot al die konsentraat is bygevoeg.Wees versigtig tydens sentrifugering indien presipitasie van proteïene voorkom, wat lei tot buissluiting.Indien neerslag voorkom, bepaal of die spesifieke oorsaak van neerslag 'n oormatige proteïenkonsentrasie of 'n onvanpaste buffer is;Eersgenoemde kan opgelos word deur ultrafiltrasie van veelvuldige ultrafiltrasiebuise gelyktydig, wat die konsentrasie verlaag, en laasgenoemde deur verskillende bufferoplossings uit te ruil totdat geen presipitasie van die proteïen plaasvind nie.
(4) Wanneer gekonsentreer tot die oorblywende 1 ml, neem 50 ul bufferoplossing, voeg 10 ul van deurvloei by en kyk of daar enige blou kleur is, as 'n oordeel of die ultrafiltrasiebuis proteïen ontbreek.As die buis lek, gooi die boonste laag weer en vloei deur in 'n nuwe buis om ultrafiltrasie te begin.Om presies te bepaal of buise gemis is, sentrifugeer vir 10 minute met 5mgml BSA voor deurvloei, loop op proteïengom, of Bradford ru-toets, en gaan voort deur die oorblywende gekonsentreerde proteïenoplossing (wat op ys werk en verhoed dat proteïene verhit word) by te voeg tot al die konsentraat is bygevoeg.Wees versigtig tydens sentrifugering indien presipitasie van proteïene voorkom, wat lei tot buissluiting.Indien neerslag voorkom, bepaal of die spesifieke oorsaak van neerslag 'n oormatige proteïenkonsentrasie of 'n onvanpaste buffer is;Eersgenoemde kan opgelos word deur ultrafiltrasie van veelvuldige ultrafiltrasiebuise gelyktydig, wat die konsentrasie verlaag, en laasgenoemde deur verskillende bufferoplossings uit te ruil totdat geen presipitasie van die proteïen plaasvind nie.
(5) Die eerste paar stappe word gebruik om die proteïen te konsentreer, en as die buffer verander moet word, voeg nuwe buffer (ultrafiltrasie deur 'n 0.22um ultrafiltrasiemembraan) versigtig by ongeveer 1ml totale proteïen, en herkonsentreer tot ongeveer 1ml vir drie opeenvolgende kere, met die finale gekonsentreerde finale volume afhangende van die verlangde proteïenkonsentrasie, gewoonlik nie meer as 500ul nie, maar ook binne 200ul.Bereik 1000 × of meer by drie geleenthede, in wese soveel bufferverandering, soos bereken deur ten minste 10 × of so volumeverryking elke keer.
(5) Die eerste paar stappe word gebruik om die proteïen te konsentreer, en as die buffer verander moet word, voeg nuwe buffer (ultrafiltrasie deur 'n 0.22um ultrafiltrasiemembraan) versigtig by ongeveer 1ml totale proteïen, en herkonsentreer tot ongeveer 1ml vir drie opeenvolgende kere, met die finale gekonsentreerde finale volume afhangende van die verlangde proteïenkonsentrasie, gewoonlik nie meer as 500ul nie, maar ook binne 200ul.Bereik 1000 × of meer by drie geleenthede, in wese soveel bufferverandering, soos bereken deur ten minste 10 × of so volumeverryking elke keer.
Postyd: Nov-09-2022